Principes De L'éClairage En Fond Noir - Optika Italy B-510 Serie Manual De Instrucciones

12.2 Principes de l'éclairage en fond noir
La microscopie fond noir est une technique d'éclairage spé-
cialisée qui tire parti de l'éclairage oblique pour améliorer le
contraste des spécimens qui ne sont pas bien représentés
dans des conditions normales d'éclairage fond clair.
Nous connaissons tous très bien l'apparence et la visibilité des
étoiles par une nuit sombre, et ce, malgré leurs énormes dis-
tances par rapport à la terre. Les étoiles peuvent être vues en
raison du contraste frappant entre leur faible lumière et le ciel
noir.
Ce principe est appliqué en microscopie en fond noir, une mé-
thode simple et populaire pour rendre les objets non tachés
clairement visibles. Ces objets ont souvent des indices de ré-
fraction très proches de ceux de leur environnement et sont
difficiles à photographier en microscopie à fond clair conven-
tionnelle. Par exemple, de nombreux petits organismes aqua-
tiques ont un indice de réfraction allant de 1.2 à 1.4, ce qui
entraîne une différence optique négligeable par rapport au
milieu aqueux environnant. Ce sont des candidats idéaux pour
l'éclairage en fond noir.
L'éclairage en fond noir exige le blocage de la lumière centrale
qui passe ordinairement à travers et autour de l'échantillon,
permettant seulement aux rayons obliques de chaque azimut
de "frapper" l'échantillon monté sur la lame du microscope. La
lentille supérieure d'un simple condenseur à fond noir d'Abbe
est sphérique concave, permettant aux rayons lumineux émer-
geant de la surface dans tous les azimuts de former un cône
creux inversé de lumière avec un sommet centré dans le plan
de l'échantillon. Si aucun échantillon n'est présent et que l'ou-
verture numérique du condenseur est supérieure à celle de
l'objectif, les rayons obliques se croisent et tous ces rayons
manqueront d'entrer dans l'objectif en raison de leur obliquité.
Le champ de vision apparaît sombre.
La paire condenseur/objectif à fond noir illustrée à la Fig. 23 est un arrangement à ouverture numérique élevée qui repré-
sente la microscopie à fond noir dans sa configuration la plus sophistiquée, qui sera examinée en détail ci-dessous.
L'objectif contient un diaphragme à diaphragme interne qui sert à réduire l'ouverture numérique de l'objectif à une valeur
inférieure à celle du cône lumineux creux inversé émis par le condenseur. Le condenseur cardioïde est une conception à
fond noir réfléchissant qui s'appuie sur des miroirs internes pour projeter un cône de lumière sans aberration sur le plan
du spécimen.
Lorsqu'un échantillon est placé sur la lame, en particulier un échantillon non coloré qui n'absorbe pas la lumière, les rayons
obliques traversent l'échantillon et sont diffractés, réfléchis et/ou réfractés par des discontinuités optiques (telles que la
membrane cellulaire, le noyau et les organites internes) permettant à ces faibles rayons de pénétrer l'objectif. Le spécimen
peut alors être vu clair sur un fond noir. En termes d'optique de Fourier, l'éclairage en fond noir élimine l'ordre zéro (lumière
non diffusée) du modèle de diffraction formé dans le plan focal arrière de l'objectif. Il en résulte une image formée exclusi-
vement à partir d'intensités de diffraction d'ordre supérieur diffusées par l'échantillon.
Les candidats idéaux pour l'éclairage en fond noir comprennent les minuscules organismes aquatiques vivants, les diato-
mées, les petits insectes, les os, les fibres, les cheveux, les bactéries non colorées, les levures et les protozoaires.
Les échantillons non biologiques comprennent les cristaux minéraux et chimiques, les particules colloïdales, les échantil-
lons de poussière et les minces sections de polymères et de céramiques contenant de petites inclusions, des différences
de porosité ou des gradients d'indice de réfraction.
Il faut faire attention lors de la préparation des échantillons pour la microscopie en fond noir, car les caractéristiques qui se
trouvent au-dessus et au-dessous du plan de mise au point peuvent aussi disperser la lumière et contribuer à la dégrada-
tion de l'image.
L'épaisseur de l'échantillon et l'épaisseur de la lame du microscope sont également très importantes et, en général, un
échantillon mince est souhaitable pour éliminer la possibilité d'artefacts de diffraction qui peuvent nuire à la formation de
l'image.
Objectif
d'ouverture
numérique
élevée
Cône lumineux
oblique
Miroir
concave
Lumière de
la source
Condenseur cardioïde pour fond noir
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Lumière aux
oculaires
Diaphragme iris
Lame de
l'échantillon
Condenseur
cardioïde
Miroir
convexe
Arrêt
lumineux
opaque
F ig. 23 F ig. 23