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TECHNOZYM
®
vWF:CBA ELISA
DESCRIÇÃO DO PRODUTO
USO
O factor von Willebrand (vWF) é uma glicoproteína multifuncional grande que ocupa uma posição-
chave na hemostase primária. Apresenta-se como estrutura múltipla e tem várias funções:
É a proteína transportadora do factor VIII no plasma e forma um complexo, protegendo, desta
maneira, o factor VIII de uma degradação proteolítica precoce.
Age como um mediador da agregação plaquetária através da adesão aos receptores nas
membranas das plaquetas (GP lb GP llb/llla) após prévia activação das plaquetas.
Ele ocupa um papel na hemostase primária, agindo como um mediador na adesão das plaquetas
ao subendotélio (parede danificada dos vasos).
Para caracterizar as propriedades de adesão, é analisada normalmente a agregação plaquetária
(sistema de medição = agregação plaquetária em dependência de ristocetina. Esta, entretanto, não
reflete a situação fisiológica e a função do vWF.
Para determinar as propriedades de adesão do vWF, é utilizada a ligação do vWF ao colágeno. A
determinação de uma ligação de vWF-colágeno corresponde à função fisiológica do vWF.
COMPOSIÇÃO
1. Tiras de teste ELISA (12): com 8 poços de teste cada; revestidas com colágeno humano tipo III;
embaladas em saco de alumínio com agente secante.
2.
Tampão de lavagem concentrado: (PBS; pH 7,3); contém detergente; 0,01% mertiolato; 1 frasco;
80 mL.
3. Tampão de incubação: (PBS; pH 7,3); contém estabilizador de proteína; Proclin 300, e corante; 1
frasco; 90 ml; pronto a usar
4. Calibradores (padrões):Numerados; liofilizados, um frasco de cada.
As concentrações são dependentes do lote, consultar as etiquetas do frasco!
5. Plasmas de controlo "nível alto" e nível baixo": para verificação; liofilizados, um frasco de cada.
As concentrações são dependentes do lote, consultar as etiquetas do frasco!
6. Conjugado: POX anti-vWF policlonal; coloração azul; 1 frasco; 0,3 mL
7. Substrato cromogéneo: TMB (tetrametilbenzidina) 1 frasco; 12 mL; pronto a usar
8. Solução de paragem: ácido sulfúrico 1,9 mol/l; 1 frasco; 12 mL, pronto a usar
9. Películas adesivas:para tiras de teste ELISA, 2 unidades
MATERIAL NECESSÁRIO (não incluído no conjunto de teste)
1. Água destilada
2. Tubos para diluição das soluções-padrão e das amostras
3. Proveta (1000 mL)
4. Pipetas de precisão (10, 100 e 1000 L)
5. Pipeta variável (1000 L)
6. Pipetas multicanal ou de dispensação (100 e 200 µL)
7. Dispositivo de lavagem ELISA ou pipeta multicanal
8. Equipamento de leitura ELISA com filtro de 450 nm (e filtro de referência de 620 nm, caso
disponível)
CONSERVAÇÃO E ESTABILIDADE
Todos os componentes da embalagem têm validade até a data impressa. A validade dos
componentes, após abrir a embalagem, reconstituição ou diluição pode ser consultada na tabela a
seguir.
Se necessário, as amostras, controlos e calibradores podem ser congelados e novamente
descongelados cinco vezes, mas é recomendada a armazenagem em alíquotas adequadas.
Material/reagente
Estado
Calibradores,
após reconstituição
plasmas de controlo
Tiras de teste ELISA
depois de aberto
Tampão
de
lavagem
depois de aberto
concentrado
1+11,5
diluição
Tampão de lavagem
concentrado
Tampão de incubação
depois de aberto
depois de aberto
Conjugado
Solução de trabalho
Substrato cromogéneo
depois de aberto
EXECUÇÃO DO TESTE
PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE PLASMA
Material das amostras:Plasma
Separação do plasma: Misturar 9 partes de sangue venoso com 1 parte de solução de citrato de sódio
(0,11 mol/L) e centrifugar durante 15 min com pelo menos 2500 de FCR (força centrífuga radial
conforme DIN 58905). A amostra de plasma pode ser conservada em temperatura ambiente durante 3
horas. Caso contrário, a amostra deve ser congelada imediatamente após a centrifugação. Validade –
20ºC: 6 meses.
PREPARAÇÃO DO REAGENTE
1. Antes de iniciar o teste, levar todos os componentes do teste à temperatura ambiente.
2. Preparação do Tampão de Lavagem: diluir uma parte de tampão de lavagem concentrado em 11,5
partes de água destilada (1+11,5). Misturar bem!(tampão de lavagem concentrado diluído =
tampão de lavagem).Eventuais formações cristalinas entram em solução a 37ºC dentro de 10 min.
3. Reconstituição dos calibradores e plasmas de controlo: Os calibradores e plasmas de controlo são
reconstituídos com 500 L de água destilada e, depois de um tempo de reconstituição de 15
minutos, misturados durante 10 segundos (misturador de amostras. Os componentes
reconstituídos são transparentes a levemente turvos.
4. Diluição dos calibradores, plasmas de controlo e amostras (1+25): Misturar 20 µL de amostra, 20 L
de calibradores ou 20 L de agentes de controlo com 500 L de tampão de incubação. Misturar
durante 10 segundos!
5. Preparação da solução de trabalho do conjugado (1+50): Diluir 1 parte de conjugado com 50 partes
de tampão de incubação
Para 8 poços de teste: misturar 20 L de conjugado com 1000 L de Tampão de incubação.
PROCEDIMENTO DO TESTE
Pipetar os calibradores diluídos,
plasmas de controlo e amostras
INCUBAÇÃO DAS AMOSTRAS
para os poços de teste. Cobrir as
Orientações 1,2)
tiras de teste com película
Incubar a temperatura ambiente
LAVAR (Orientações 1,3,4)
Tampão de lavagem
Pipetar a solução de trabalho de
conjugado
REAÇÇÃO DO CONJUGADO
teste.Cobrir as tiras de teste com
(Orientações 1,2)
película
Incubar a temperatura ambiente
LAVAR (Orientações 1,3,4)
Tampão de lavagem
Pipetar a solução de substrato para
REAÇÇÃO DO SUBSTRATO
os poços de teste.Cobrir as tiras de
teste com película nova
(Orientação 1,2)
Incubar a temperatura ambiente
Pipetar a solução de paragem para
PARAR (Orientação 1,2)
os poços de teste
MEDIÇÃO (Orientação 5)
Instrumento de leitura ELISA, 450nm
Armazenagem
Estabilidade
Temperatura ambiente
8 horas
-20°C
6 meses
2 ... 8 ºC com filme adesivo em
Data
saco de alumínio, com agente
validade
secante
2 ... 8ºC
6 meses
do
2 ... 8 °C
3 semanas
2 ... 8 °C
2 meses
2 ... 8 °C
6 meses
Temperatura ambiente
60 minutos
Data
2 ... 8 °C
validade
100 µL
45 minutos
3x200 µL
para
os
poços
de
100 µL
45 minutos
3x200 µL
100 µL
15 minutos
100 µL
Orientações
1.
Reagentes de lotes diferentes não podem ser misturados.
2.
A precisão e o desempenho dependem, entre outros, dos seguintes factores:
Misturar bem todas as soluções de diluição, 10 segundos no vortex.
Execução de testes em duplicado
Incubação na temperatura correcta (Temperatura ambiente: 20...25 °C)
Observação exacta da sequência de pipetagem e cronometragem:
O tempo indicado para a incubação da amostra, reacção do conjugado e do substrato é contado
depois de pipetar a última amostra. Os tempos de incubação não devem variar em mais do que +
10%.
Na
incubação
da
calibradores/amostras/plasmas de controlo ou solução de conjugado não devem ultrapassar 60
segundos para cada tira de teste ELISA (8 poços).
Na reacção do substrato e na paragem, o tempo para pipetar o substrato ou a solução de paragem
não deve ultrapassar 10 segundos para cada tira de teste ELISA. O uso de pipetas multicanal ou
pipetas de dispensação permite reduzir o tempo de pipetagem.
3. Marcar as tiras de teste com caneta à prova de água, para o caso de acidentalmente saírem do
seu lugar durante o teste.
4. Após o último procedimento de lavagem, os poços de teste devem ser aspirados completamente e
batidos sobre papel absorvente.
5. Através da medição em comprimentos de ondas diferentes a 450 nm e 620 nm (ou 690nm), a
precisão do teste será aumentada.
6. Agitar 10 segundos, medição dentro de 10 minutos
LIMITAÇÃO DA EXECUÇÃO DO TESTE
Níveis reduzidos de vWF:CBA são associados ao grupo sanguíneo 0.
O vWF:CBA também é influenciado pelo trabalho físico, gravidez (anticoncepcionais via oral) e raça.
Os antigénios aumentam com a idade.
ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES
-
Todos os produtos de sangue humano, plasma e amostras devem ser considerados como
potencialmente infecciosos. Devem ser manuseados com os cuidados necessários e conforme os
regulamentos de segurança e devem ser removidos como lixo hospitalar. Os calibradores e
controlos, produzidos com sangue humano e cada plasma individual
resultado negativo nos testes referentes ao HBsAg, HIV Ac e HCV Ac (ver etiqueta externa ou no
frasco).
-
A solução de paragem (ácido sulfúrico) pode ocasionar irritações da pele. No caso do ácido atingir
os olhos, lavar imediatamente com bastante água e consultar um médico!
-
Alguns reagentes contêm conservantes (mertiolato).Não ingerir! Evitar contacto com a pele ou
mucosas!
RESULTADOS DAS ANÁLISES
CÁLCULO DOS RESULTADOS
Elaboração da curva de calibração: Eixo X: Concentração vWF:CBA U/mL (1 U/mL = 100%)
A curva de calibração é linear-linear, com ajuste ponto ao ponto ou cúbico ( "cubic spline")
Avaliação da curva de calibração
A extinção do calibrador mais alto deve situar-se entre 1,0 e 2,5.
A validade do teste pode ser verificada com base nos valores de controlo determinados.
Exemplo de uma curva-padrão:
de
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
0,2
0,4
de
Determinação das concentrações das amostras
Fazer a leitura das concentrações das amostras na curva de calibração.
Caso o valor de extinção de uma amostra se situe acima do valor do padrão mais alto, então a
amostra deve ser previamente diluída com tampão de incubação (1+1). Neste caso, a
concentração determinada é multiplicada pelo factor de diluição 2.
VALORES DE REFERÊNCIA
Os valores normais de vWF:CBA situam-se entre 0,4 – 2,5 U/mL (40-250%) (Fig 1)
Recomenda-se que cada laboratório determine o seu próprio intervalo normal.
ESTANDARDIZAÇÃO
O material de calibração utilizado é o padrão internacional da WHO (Organização Mundial da Saúde)
para o factor de coagulação VIII e para o vWF no plasma humano.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
Os dados do desempenho são mostrados abaixo. Os resultados obtidos em laboratórios individuais
podem ser diferentes.
PRECISÃO
A reprodutibilidade foi determinada com amostras diferentes (em séries e dia a dia). Foram obtidos os
seguintes resultados:
Intra assay
Amostra 1
N
24
Mean (U/mL)
1,372
SD (U/mL)
0,020
CV (%)
1,47%
COMPARAÇÃO DE MÉTODOS OU CORRELAÇÃO
O TECHNOZYM vWF:CBA (Technoclone) foi correlacionado com dois ensaios medindo 113 amostras
( 24 amostras de indivíduos normais e 89 amostras de pacientes com VWD, classificados como tipo 1
(n=26), tipo 2A/2B (n=11), tipo 2M (n=45), tipo 2N (n=4) e tipo 3 (n=3)).
Com o Asserachrom vWF:CB da Stago (usa colagénio humano tipo III) foi observada uma correlação
de r=0.98, declive=0.90. Com o Collagen Binding Assay da Life Diagnostics ( usa colagénio de cavalo,
95% tipo I, 5% tipo III) foi observada uma correlação de r=0.99, declive=0.95.
INTERVALO DO ENSAIO:
0.01 – 1.70 U/mL
No entanto o intervalo efectivo de cada corrida de teste vai depender do valor do calibrador testado.
LIMITE DE DETECÇÃO:
0,01 U/ml
LITERATURA
1) Blood 69; 1691 – 1695, 1987. The effect of ABO blood group on the diagnosis of vWD. Gill et al.
2) Thromb Haemost 2000; 83: 127 – 35. Collagen Binding Assay for von Willebrand Factor (VWF:CBA) Detection
of VWD and discrimination of VWD Subtypes, Depends on Collagen Source. E J Favaloro
3) Haemophilia (Suppl. 3), 1998, 15 – 24. The determination of von Willebrand factor activity by collagen binding
assay. Siekmann et al.
6 / 8
amostra
e
reacção
do
conjugado,
o
Eixo Y:Extinção (OD)
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
vWF:CBA U/ml
Inter assay
Amostra 2
Amostra 1
24
10
1,630
1,366
0,029
0,074
1,75%
5,39%
PT
tempo
para
pipetar
os
utilizado acusaram um
Amostra 2
10
0,306
0,013
4,13%
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