Amplificación Del Material Genético; Materiales Necesarios; Procedimiento - INGENASA INgene q IBV SYBR Instrucciones De Uso

Existen varias casas comerciales con productos para extracción que dan una calidad óptima de ácido nucleico, siguiendo
las indicaciones del fabricante, entre ellas: Life-technologies, ROCHE, Qiagen, Marchery Nalgene, otras.
PRECAUCIÓN: si la amplificación no es inmediata, conservar el RNA a -20ºC.
8. AMPLIFICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO

MATERIALES NECESARIOS

Hielo picado.
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ARN extraído de las muestras.
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Mezclas A, B y tampón de amplificación– MANTENER EN HIELO PICADO SIEMPRE QUE ESTÉ FUERA DEL
-
REFRIGERADOR.
Control positivo de amplificación A1 (IBV).
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Agua libre de RNAsas y DNAsas.
-

PROCEDIMIENTO

1. Preparar y marcar convenientemente, tantos tubos para la amplificación como muestras vayan a procesarse;
añadir un tubo adicional para el control positivo de amplificación, y otro para el control negativo.
2. Sacar las mezclas A, B y tampón de amplificación del congelador. Mantener en hielo picado hasta su total
descongelación. Agitarlas ligeramente para su correcta homogenización y preparar la mezcla de amplificación
en volumen necesario para el número de muestras que vayan a procesarse. Tener en cuenta los controles que se
van a introducir en el ensayo, que serán al menos un control positivo y un control negativo.
El volumen a mezclar de cada reactivo por cada una de las muestras será:
Por muestra a procesar
Para un total de 10 muestras
El tubo donde vaya a realizarse la mezcla, es conveniente que se mantenga en todo momento en hielo picado.
Se recomienda preparar la mezcla en exceso (calcular un 10% adicional de todos los reactivos) a fin de
compensar las posibles pérdidas de volumen durante los pipeteos. Una vez preparada la mezcla homogeneizar
correctamente.
3. Disponer los tubos previamente etiquetados en hielo picado y añadir a cada uno 20 µl de la mezcla así
preparada.
4. Añadir a cada uno de los tubos 2 µl de la muestra de ARN extraído previamente. Añadir 2 µl del control positivo
de amplificación A1 al tubo de control positivo y 2 µl de agua al tubo marcado como control negativo. Mezclar
suavemente el contenido de cada tubo y asegurarse de que todo el líquido se encuentra depositado en el fondo
del tubo. Si no fuera así, centrifugar ligeramente hasta conseguirlo.
5. Siguiendo el manual de instrucciones de uso del termociclador a tiempo real, la reacción se coloca en el
termociclador y se programa con arreglo a las siguientes condiciones:
INSTRUCCIONES DE USO – ESPAÑOL
Mezcla A T. amplificación
10 µl 10 µl
100 µl 100 µl
Mezcla B Master Mix Final
0.5 µl 20.5 µl
5 µl 205 µl
(Versión 1410-14) – PAG.4.