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Leica Microsystems Heidelberg GmbH
Generalidades
Formación de imágenes confocales
¿En qué consiste la microscopía confocal?
Si bien se encuentra en estudio desde 1953, no ha sido hasta los últimos 10 años cuando la
microscopía de barrido láser confocal se ha convertido en una técnica utilizada con frecuencia en la
práctica. En la actualidad, es la técnica más utilizada en la investigación biológica, en la analítica
química y en la examinación de material. Un dispositivo de este tipo aúna los resultados de una larga
investigación con el desarrollo en diferentes ámbitos: microscopía, tecnología láser y óptica para luz
coherente, tecnología de vídeo, electrónica y tecnología para ordenadores.
En la microscopía confocal se reconocen estructuras en las que la luz emitida o reflejada por una
muestra se concentra en un solo plano focal y se superpone a toda la luz que no procede de dicho
plano.
En un barrido puntual confocal, las lentes del microscopio enfocan la luz láser sobre un solo punto de
la muestra (el punto focal). A continuación, el láser explora la muestra punto por punto y genera la
imagen barrida. La fluorescencia y la luz reflejada por la muestra vuelven atravesando el objetivo.
El microscopio y el sistema óptico del módulo de barrido enfocan la luz emitida por el punto focal
sobre un segundo punto, el punto confocal. A través de la pequeña abertura de este punto
(denominada pinhole), la luz del punto focal llega hasta el detector. La luz que no procede de este
foco no atraviesa la abertura.
El principio confocal se representa de forma esquemática para la microscopía de epifluorescencia.
Como en otros microscopios de epifluorescencia, la lente se utiliza al mismo tiempo como
condensador y como objetivo. La gran ventaja es que desaparece la necesidad de equilibrar dos
lentes con exactitud y ajustarlas entre sí. Un difusor de rayos (un espejo dicroico) refleja el rayo láser
colimado y polarizado que se introduce a través de una ranura sobre la parte trasera de la lente del
objetivo y lo enfoca sobre la muestra. La luz que refleja la muestra vuelve a atravesar la misma lente.
El rayo de luz se enfoca a través del pinhole (es decir, la ranura confocal) para excluir, de esta forma,
la luz extrafocal, es decir, la emitida por zonas de la muestra que están por encima o por debajo del
plano focal. El volumen del corte óptico depende de diferentes parámetros como el diámetro
(variable) de la abertura y la longitud de onda. Un detector sensible a la luz (por ejemplo un
fotodiodo) colocado tras la abertura confocal registra los datos intrafocales de cada punto de la
muestra. La señal de salida analógica se digitaliza y transmite a un ordenador.
El detector consiste en un detector puntual que sólo recibe la luz de un punto de la muestra. De esta
forma, el microscopio confocal permite observar sólo un punto de la muestra en cada momento, a
diferencia del microscopio convencional con el que puede verse una zona mayor de la muestra. Así,
la imagen completa de la muestra sólo se consigue mediante la exploración punto por punto de ésta,
para lo cual debe desplazarse el punto luminoso o la muestra. Ambas posibilidades han conducido al
desarrollo de dos tipos diferentes de microscopios confocales:
Microscopios con platina móvil (barrido en etapas): la platina con la muestra se desplaza un poco tras
cada exposición mientras que el sistema óptico permanece quieto.
Microscopios con técnica de rayo o de espejo: el punto luminoso se desplaza sobre la muestra que
se encuentra fija y la recorre punto por punto con ayuda de pequeños y rápidos espejos accionados
mediante un galvanómetro, como los que utiliza LEICA.
El sistema TCS SP2 de LEICA permite crear un solo plano focal, así como toda una serie de planos
(horizontales o verticales). Un corte único vertical o un barrido xz, ofrece una vista lateral de la
muestra.
La recogida de una secuencia de cortes ópticos de la muestra como lote de imágenes y su posterior
procesamiento digital presenta la ventaja de que este bloque de datos de varias dimensiones permite
generar una imagen bidimensional calculada (proyección) o una representación reducida en 3
dimensiones de la muestra en un ordenador apropiado.
Poder resolutivo óptico
El término resolución hace referencia a la capacidad de distinguir entre los detalles más precisos de
una estructura. En un microscopio ideal, el sistema óptico estaría libre de todo tipo de aberraciones.
En este instrumento hipotético, el poder resolutivo estaría limitado exclusivamente por la difracción.
Ésta puede definirse como la distancia más pequeña entre dos puntos de una muestra a la que éstos
puntos pueden verse siempre como puntos separados (criterio Rayleigh). A partir de éste límite,
ambos puntos se fusionan entre sí (es decir, los aros de difracción se superponen de forma parcial o
total) y no pueden reconocerse como dos puntos independientes. Esta distancia se calcula a partir
Manual del usuario de Leica TCS SP2 español
Art. n.º: 159330056 / Vers.: 31102002
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