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Deconvolución y compensación
Deconvolución espectral
La deconvolución espectral es un concepto importante para comprender cómo se generan
y analizan los datos utilizando el citómetro de flujo NL-CLC con el software SpectroFlo.
La deconvolución espectral se utiliza para identificar la señal de fluorescencia de cada
fluorocromo utilizado en un experimento determinado.
Comprender la citometría de flujo espectral
Debido a que los fluorocromos emiten luz en un intervalo de longitudes de onda, por lo general
se utilizan filtros ópticos para limitar el intervalo de frecuencias medidas por un detector
determinado. Sin embargo, cuando se utilizan dos o más fluorocromos, la superposición de los
intervalos de longitud de onda a menudo hace imposible que los filtros ópticos aíslen la luz de
un fluorocromo determinado. Como resultado, la luz emitida por un fluorocromo aparece
en un detector no primario (un detector destinado a otro fluorocromo). Esto se denomina
contaminación espectral. En citometría de flujo convencional, la contaminación espectral se puede
corregir mediante un cálculo matemático llamado compensación. Se deben adquirir controles de
tinción única para calcular la cantidad de contaminación espectral en cada uno de los detectores
no primarios.
La capacidad de medir el espectro de emisión completo de un fluorocromo permite que el sistema
utilice un método diferente para aislar la señal deseada de la señal no deseada. La clave para
diferenciar los diferentes fluorocromos es que tengan patrones o firmas diferentes en todo el
espectro. Debido a que el sistema está detectando el intervalo completo de emisión de un
determinado fluorocromo, y no solo la emisión máxima, dos colorantes con una emisión similar
pero diferentes firmas espectrales se pueden distinguir entre sí. El método matemático para
diferenciar las señales de varios fluorocromos/colorantes se denomina deconvolución espectral
y da como resultado una matriz de deconvolución que se aplica a los datos. Aunque no es
matemáticamente idéntico a la compensación convencional, el principio general es el mismo.
Al igual que para la compensación, siguen siendo necesarios los controles de tinción única,
identificados en el software SpectroFlo como controles de referencia, ya que proporcionan
la información de todo el espectro de fluorescencia necesaria para realizar la deconvolución
espectral.
Una ventaja de la deconvolución es la capacidad de extraer la autofluorescencia de una muestra
y tratarla como un parámetro diferente. Esto es especialmente útil cuando se realizan análisis con
partículas que tienen una autofluorescencia elevada y para las que ese fondo elevado afecta a la
resolución de las señales fluorescentes. Por experimento, se puede definir un control sin teñir
o varios controles sin teñir (uno por grupo), dependiendo de si las muestras multicolores tienen
las mismas o diferentes firmas de autofluorescencia.
Capítulo 6: Deconvolución y compensación
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