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Resumen de contenidos para Qiagen ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR
- Página 1 Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR ® Versión 1 Diagnóstico in vitro cuantitativo Para uso con el equipo Rotor-Gene ® Q MDx 5plex HRM 670923 QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, Alemania 1090231ES Sample & Assay Technologies...
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Página 2: Qiagen: Tecnologías Para La Preparación De Muestras Y Ensayos De Biología Molecular
QIAGEN: tecnologías para la preparación de muestras y ensayos de biología molecular QIAGEN es el proveedor líder de tecnologías innovadoras para la preparación de muestras y ensayos de biología molecular que permiten el aislamiento y la detección del contenido de cualquier muestra biológica. Nuestros productos y servicios de vanguardia y máxima calidad garantizan el éxito, desde la... -
Página 3: Tabla De Contenido
Procedimiento Protocolo de lisis de eritrocitos para el aislamiento de leucocitos totales a partir de sangre total Aislamiento de ARN total Cualificación y cuantificación del ARN Concentración de ARN (paso opcional) Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... - Página 4 Control de calidad Limitaciones Características de rendimiento Límite de blanco Límite de detección Linealidad Repetibilidad y reproducibilidad Sustancias interferentes Validación clínica y comparación de métodos Referencias Símbolos Información de contacto Información para pedidos Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
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Página 5: Uso Previsto
Uso previsto El kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR es un ensayo cuantitativo de diagnóstico in vitro para la medición del gen de fusión BCR-ABL1 y de los tránscritos b3a2 (e14a2) y b2a2 (e13a2) en ARN total extraído de sangre total. -
Página 6: Monitorización De La Enfermedad
20 metafases de médula ósea. El nivel de respuesta citogenética se determina de acuerdo con el porcentaje de metafases positivas para el cromosoma Ph (consulte la tabla 1) (3). No obstante, la estimación depende del rendimiento Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... - Página 7 BCR-ABL1 Mbcr (5-7). Asimismo, recientemente se ha validado un panel de referencia auspiciado por la OMS para conseguir una estandarización sencilla de la cuantificación de BCR-ABL1 (8). Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
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Página 8: Principio Del Procedimiento
PCR. De acuerdo con estos requisitos, la amplificación no específica no se detecta. Por lo tanto, el aumento de la fluorescencia es directamente proporcional a la amplificación del objetivo durante la PCR. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... - Página 9 Este proceso libera el fluoróforo y el supresor en la solución, separándolos físicamente y causando un aumento de la fluorescencia de FAM y un descenso de la fluorescencia de BHQ-1. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
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Página 10: Materiales Suministrados
Mbcr y ABL1 (10 copias/5 µl) SP5-BCR-ABL Mbcr and ABL: Dilución del estándar plasmídico individual Amarillo 70 µl Mbcr y ABL1 (10 copias/5 µl) La tabla continúa en la página siguiente. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... -
Página 11: Materiales Requeridos Pero No Suministrados
* Los compuestos químicos y los equipos recomendados para la lisis de eritrocitos y el aislamiento de ARN son potencialmente biopeligrosos. Cerciórese de utilizar el equipo de protección individual adecuado y adopte las medidas de seguridad necesarias antes de su uso. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... -
Página 12: Reactivos Para El Aislamiento De Arn Total
ARN son potencialmente biopeligrosos. Cerciórese de utilizar el equipo de protección individual adecuado y adopte las medidas de seguridad necesarias antes de su uso. Compruebe que los equipos se han revisado y calibrado según las recomendaciones † del fabricante. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... -
Página 13: Advertencias Y Precauciones
Puede obtenerlas en línea en el práctico y compacto formato PDF en www.qiagen.com/safety, desde donde también podrá buscar, ver e imprimir las hojas de datos SDS de todos los kits y componentes de los kits QIAGEN®. Todos los materiales químicos y biológicos son potencialmente peligrosos. Las muestras son material potencialmente infeccioso y deben tratarse como material biopeligroso. -
Página 14: Precauciones Generales
Deseche los residuos de muestras y ensayos conforme a los procedimientos de seguridad local. Los reactivos suministrados con el kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR presentan una dilución óptima. No realice más diluciones de los reactivos porque podrían perder eficacia. -
Página 15: Manipulación Y Almacenamiento De Reactivos
Manipulación y almacenamiento de reactivos Condiciones de envío El kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR se suministra en hielo seco. Si alguno de los componentes del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR no está congelado a la llegada, si el embalaje externo se ha abierto durante el transporte o si el envío no incluye la nota de embalaje o los reactivos, póngase... -
Página 16: Estabilidad
RNeasy MinElute Cleanup Kit (n.º de referencia 74204), consulte los manuales correspondientes. Manipulación y almacenamiento de muestras El kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR está diseñado para su uso con muestras de ARN extraídas de sangre total. Todas las muestras deben tratarse como potencialmente peligrosas. -
Página 17: Muestras De Arn
Nota: las muestras de ARN deben enviarse bajo las mismas condiciones en las que se encuentran las muestras almacenadas para evitar cambios de temperatura durante el almacenamiento y el envío. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... -
Página 18: Procedimiento
ARN y la concentración de ARN no están caducados y se han transportado y almacenado en las condiciones adecuadas. Utilice el kit RNeasy Midi (QIAGEN, n.º de referencia 75144) y el tampón para lisis de eritrocitos (QIAGEN, n.º de referencia 79217) para la purificación de ARN a partir de sangre total periférica. - Página 19 Antes de comenzar Prepare el tampón RLT (suministrado con el kit RNeasy Midi (QIAGEN, n.º de referencia 75144)/β-mercaptoetanol (β-ME): añada 10 µl de β-ME por 1 ml de tampón RLT. El tampón RLT permanece estable durante 1 mes después de añadir β-ME.
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Página 20: Aislamiento De Arn Total
En caso necesario, descongele el lisado de leucocitos a temperatura ambiente antes de empezar el protocolo de aislamiento de ARN. Prepare 4 ml de etanol al 70% para cada muestra. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... - Página 21 Nota: el tampón RPE se suministra como concentrado. Asegúrese de que se ha añadido etanol al tampón RPE antes de utilizarlo. Reutilice el tubo de centrífuga en el paso 5. No es preciso descartar el flujo continuo. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
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Página 22: Cualificación Y Cuantificación Del Arn
200 ng/µl. Si la concentración de ARN del eluato es inferior a 200 ng/µl, debe aumentarse la concentración de ARN del eluato mediante el kit de limpieza RNeasy MinElute (QIAGEN, n.º de referencia 74204). Si la concentración de ARN del eluato excede el límite superior del rango, la concentración debe ajustarse a 200 ng/µl con agua libre de RNasa. -
Página 23: Concentración De Arn (Paso Opcional)
RNasa, añada 700 µl de tampón RLT y mezcle bien. 2. Añada 500 µl de etanol al 96-100% al ARN diluido y mezcle bien mediante pipeteo. No centrifugue la mezcla. Continúe de inmediato por el paso 3. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... - Página 24 Coloque las tapas de modo que estén orientadas hacia la dirección opuesta a la rotación del rotor (p. ej., si el rotor gira en el sentido de las agujas del reloj, oriente las tapas en sentido antihorario). Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
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Página 25: Transcripción Inversa
PCR. La cantidad necesaria es de 3 µg de ARN por muestra. El kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR contiene reactivos suficientes para realizar 3 series analíticas de 8 muestras. - Página 26 Nota: vuelva a colocar todos los reactivos para transcripción inversa del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR en el congelador después de preparar las reacciones para evitar la degradación de los materiales. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
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Página 27: Experimento De Qpcr En El Equipo Rotor-Gene Q Mdx 5Plex Hrm Con Rotor De 72 Tubos
Se recomienda realizar todas las mediciones por duplicado, tal como se indica en la tabla 3. El kit permite analizar por duplicado 8 muestras de ADNc en el mismo experimento. Con el kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR pueden realizarse tres experimentos. -
Página 28: Procesamiento De Muestras En El Equipo Rotor-Gene Q Mdx Con Rotor De 72 Tubos
Recomendamos analizar como mínimo 8 muestras de ADNc en el mismo experimento para optimizar el uso de los estándares y las mezclas de primers y sondas. El esquema del rotor de la ilustración 3 muestra un ejemplo de experimento. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... - Página 29 BCR-ABL1 Mbcr y ABL1; HC: control positivo alto; LC: control positivo bajo; IS-Cal: calibrador IS-MMR; RTneg: control negativo para TI; S1-S8: muestras de ADNc; H O: control de agua. Nota: coloque tubos vacíos en todas las posiciones vacías. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
- Página 30 (mezcla para qPCR ABL1 o mezcla para qPCR Mbcr). Se incluyen volúmenes extra para compensar los errores de pipeteo. Nota: no utilice volúmenes de reacción (mezcla de reacción más muestra) inferiores a 25 µl. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
- Página 31 5. Nota: vuelva a colocar todos los componentes del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR en el congelador para evitar la degradación de los materiales. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
- Página 32 Defina el umbral en 0.03 (en la parte derecha inferior de la ventana). Seleccione “Dynamic Tube” (Tubo dinámico) como método de normalización en el informe y “Slope Correct” (Pendiente correcta) para corregir el ruido de la pendiente. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
- Página 33 Una vez realizados todos los pasos, compruebe que se están registrando los datos iniciales y proceda a realizar el análisis de los resultados tal como se describe a continuación. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
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Página 34: Resultados
0,30 alto 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 Umbral 0,00 Ciclo Ilustración 4. Detección de ABL1 con controles y estándares SP3, SP4, SP5 y SP6. , 10 , 10 y 10 copias/reacción. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... -
Página 35: Curvas Estándar Y Criterios De Calidad Aplicables A Los Datos Iniciales
1, 2, 3, 5 y 6 para SP1, SP2, SP3, SP5 y SP6. La ilustración 6 muestra un ejemplo de una curva ABL1 calculada a partir de 4 diluciones estándar. La ilustración 7 muestra un ejemplo de una curva BCR-ABL1 Mbcr calculada a partir de 5 diluciones estándar. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... - Página 36 –3,3. Una pendiente entre –3,1 y –3,6 es aceptable siempre que R² sea > 0,95. No obstante, es recomendable un valor de R² > 0,98 para obtener resultados precisos. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
- Página 37 C debería ser superior a la inter- sección de las curvas estándar, respectivamente. Un resultado positivo para los controles NTC indica contaminación cruzada durante la transcripción inversa y/o la qPCR. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
- Página 38 El resultado de NCN obtenido a partir del calibrador IS-MMR, probado con el kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR, debe encontrarse dentro del intervalo 0,05-0,3 puesto que, de lo contrario, los valores de NCN no se pueden convertir a escala internacional.
- Página 39 Determine el estado de respuesta molecular de cada muestra de acuerdo con la interpretación especificada en la tabla 6. Resumen de los criterios de calidad La tabla 7 resume los diversos criterios de calidad y los valores o resultados asociados. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
- Página 40 RM 4 Sustituir CN por LOD ≤ 0,0032 RM 4,5 ≤ LOB – Sin detectar/RM 5 LOB: límite de blanco; LOD: límite de detección; RM: respuesta molecular; RMM: respuesta molecular mayor. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
- Página 41 : ciclo umbral; HC: control alto; IS: estándar internacional; LC: control bajo; RM: respuesta molecular; RMM: respuesta molecular mayor; NCN: número de copias normalizado; NTC: control sin molde; RTneg: negativo para transcripción inversa. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
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Página 42: Guía De Resolución De Problemas
(Frequently Asked Questions) de nuestro Centro de servicio técnico: www.qiagen.com/FAQ/FAQList.aspx. Los científicos del servicio técnico de QIAGEN se encargarán de responder cualquier pregunta que tenga sobre la información y los protocolos de este manual, así como sobre las tecnologías para la preparación de muestras y ensayos de biología molecular (encontrará... - Página 43 Kit ipsogen BCR-ABL1 Compruebe las condiciones de almacenamiento Mbcr RGQ RT-PCR y la fecha de caducidad de los reactivos (en la caducado etiqueta del kit) y, si es necesario, utilice un kit nuevo. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
- Página 44 (en la caducado etiqueta del kit) y, si es necesario, utilice un kit nuevo. c) Cantidad inicial Verifique siempre la concentración del ARN de ARN objetivo antes de empezar. demasiado baja Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
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Página 45: Control De Calidad
Todos los reactivos suministrados con el kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR se suministran para su uso exclusivo con otros reactivos del mismo kit. El uso de otros reactivos o reactivos de otros lotes puede interferir en el rendimiento. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... -
Página 46: Características De Rendimiento
El kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR se ha validado únicamente para sangre total anticoagulada en EDTA de potasio (EDTA-K2) procedente de pacientes diagnosticados de LMC con cromosoma Filadelfia positivo (Ph+) p210 en fase crónica. El rendimiento del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR se ha determinado mediante el uso del kit RNeasy Midi (n.º... -
Página 47: Linealidad
Linealidad La linealidad se determinó siguiendo el estándar EP6-A del CLSI/NCCLS con un lote del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR en 9 muestras distintas preparadas mediante diluciones sucesivas de ARN positivo extraído de líneas celulares y ARN negativo extraído de donantes sanos. La determinación se realizó... -
Página 48: Sustancias Interferentes
ARN han sido elegidas por su efecto potencial en la PCR (bilirrubina no conjugada, bilirrubina conjugada, hemoglobina [humana], albúmina sérica [humana], exceso de EDTA de potasio [EDTA-K2] y etanol). Los resultados obtenidos no mostraron efectos interferentes con estas sustancias. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... -
Página 49: Validación Clínica Y Comparación De Métodos
Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr IS-MMR DX (IS-NCN log) Ilustración 8. Gráfico de IS-NCN obtenido con el kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR y el kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr IS-MMR DX. Estudio 2: se analizaron 39 muestras de ARN extraídas de sangre periférica procedente de pacientes diagnosticados previamente de LMC con Ph+ y en tratamiento con TKI en un hospital francés con el kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr... -
Página 50: Referencias
La siguiente tabla de contingencia se diseñó para comparar el estado clínico establecido con ambos métodos. Existe una gran concordancia entre el kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR y el método de referencia (concordancia general = 97,4%), tal como se muestra en la ilustración 9. - Página 51 Velden, V.H., Hochhaus, A., Cazzaniga, G., Szczepanski, T., Gabert J., and van Dongen, J.J. (2003) Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects. Leukemia 17, 1013. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
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Página 52: Símbolos
Centro de servicio técnico en el sitio www.qiagen.com/Support, llame al 00800-22-44-6000, póngase en contacto con uno de los departamentos del servicio técnico de QIAGEN o con los distribuidores locales (consulte la contraportada o visite www.qiagen.com). Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... -
Página 53: Información Para Pedidos
250 tiras de 4 tubos y tapones para 981103 0.1ml (250) 1.000 reacciones Strip Tubes and Caps, 10 × 250 tiras de 4 tubos y tapones 981106 0.1ml (2500) para 10.000 reacciones Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014... - Página 54 QIAGEN correspondiente. Los manuales y las guías del usuario de los kits de QIAGEN están disponibles en www.qiagen.com o pueden solicitarse a los servicios técnicos de QIAGEN o a su distribuidor local. Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014...
- Página 55 Este producto está destinado para el diagnóstico in vitro. Los productos QIAGEN no deben ser revendidos, modificados para reventa ni utilizados para fabricar otros productos comerciales sin autorización por escrito de QIAGEN. La información del presente documento puede ser modificada sin previo aviso. QIAGEN no asume ninguna responsabilidad por los errores que puedan aparecer en este documento.
- Página 56 Australia techservice-au@qiagen.com Austria techservice-at@qiagen.com Belgium techservice-bnl@qiagen.com Brazil suportetecnico.brasil@qiagen.com Canada techservice-ca@qiagen.com China techservice-cn@qiagen.com Denmark techservice-nordic@qiagen.com Finland techservice-nordic@qiagen.com France techservice-fr@qiagen.com Germany techservice-de@qiagen.com Hong Kong techservice-hk@qiagen.com India techservice-india@qiagen.com Ireland techservice-uk@qiagen.com ...