Cualificación Y Cuantificación Del Arn - Qiagen ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR Manual

5. Añada otros 2,5 ml de tampón RPE a la columna RNeasy. Cierre el tubo de
centrífuga con suavidad y centrifugue durante 5 minutos a 4.000 × g para
secar la membrana de gel de sílice.
Nota: es importante secar la membrana de RNeasy puesto que los restos de
etanol pueden interferir en las reacciones posteriores. Esta centrifugación
permite descartar el arrastre de etanol durante el paso de elución.
Nota: después de la centrifugación, retire con cuidado la columna RNeasy
del tubo de centrífuga para que no entre en contacto con el flujo continuo
y evitar el arrastre de etanol.
6. Para realizar la elución, transfiera la columna RNeasy a un tubo de
recogida de 15 ml nuevo (suministrado). Pipetee 200 µl de agua libre de
RNasa directamente en la membrana de gel de sílice RNeasy. Cierre el tubo
con suavidad. Déjelo reposar durante 1 minuto y, a continuación,
centrifugue durante 3 minutos a 4.000 × g.
7. Repita el paso de elución (paso 6) utilizando el eluato obtenido en el paso 6
y centrifugue a continuación durante 5 minutos a 4.000 × g.
Nota: para realizar un almacenamiento a largo plazo, el ARN se puede
almacenar a una temperatura comprendida entre –65 y –90 °C.
Cualificación y cuantificación del ARN
La calidad del ensayo depende en gran medida de la calidad del ARN inicial.
Por este motivo, recomendamos utilizar ARN purificado mediante electroforesis
en gel de agarosa o espectrofotometría antes del análisis.
Para calibrar el espectrofotómetro se debe utilizar un blanco de agua

exenta de nucleasas de calidad PCR.
Una OD de 1,0 a 260 nm es equivalente a aproximadamente 40 µg/ml

de ARN monocatenario.
Un cociente OD

de purificación de alta calidad.
Para realizar el paso de transcripción inversa, la concentración de ARN
requerida es de 200 ng/µl. Si la concentración de ARN del eluato es inferior
a 200 ng/µl, debe aumentarse la concentración de ARN del eluato mediante
el kit de limpieza RNeasy MinElute (QIAGEN, n.º de referencia 74204).
Si la concentración de ARN del eluato excede el límite superior del rango,
la concentración debe ajustarse a 200 ng/µl con agua libre de RNasa.
Nota: compruebe la concentración de ARN después de la normalización.
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/OD comprendido entre 1,8 y 2,1 indica un ARN
260 280
Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014