Preparación De La Pcr - Qiagen PyroMark Q24 MDx Manual De Usuario

Apéndice B
PyroMark ADSW, se indicará el cebador que debe ser
biotinilado.
El cebador biotinilado se debe purificar mediante HPLC o
mediante un procedimiento equivalente, ya que la biotina
libre competirá con el producto de la PCR biotinilado por los
sitios de unión en las microesferas de sefarosa recubiertas
de estreptavidina.
Longitud de los amplicones
La longitud óptima de los amplicones para los ensayos de
pirsecuenciación se sitúa entre los 80 y 200 bp, aunque
también pueden funcionar correctamente los productos de
hasta 500 bp. Se recomienda que los amplicones para los
ensayos CpG sean más cortos que 200 bp.
Cebador de secuenciación
Diseñe los cebadores de secuenciación mediante el
PyroMark ADSW. Cuando diseñe un ensayo InDel, se
recomienda que el cebador de secuenciación esté ubicado
unas pocas bases delante de la posición variable.
Recomendamos utilizar para la pirosecuenciación ensayos
de QIAGEN con etiqueta DIV que incluyan todos los
cebadores optimizados necesarios.
Preparación de la PCR
Las reacciones PCR de 25 µl se preparan con el kit PyroMark
PCR. Siga las instrucciones del PyroMark PCR Handbook
(Manual PyroMark PCR).
Ejecute la PCR a una temperatura de annealing óptima
durante 45 series analíticas. Si se realizan menos series, el
rendimiento puede ser insuficiente y pueden aparecer
problemas de fondo en las reacciones de pirosecuenciación
debido al exceso de cebador biotinilado no utilizado.
El producto de la PCR debe proporcionar una banda intensa
con un exceso mínimo de cebadores cuando se analiza en
un gel de agarosa.
B-2 Manual de usuario del PyroMark Q24 MDx 01/2016