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4.
En una placa de 96 pocillos dispensar 15 µL del Mix A a los pocillos correspondientes a las
filas A, B, C, D, E y F de la placa. Habrá que rellenar tantas columnas como número de
muestras o controles se vayan a analizar simultáneamente.
5.
De la misma manera, dispensar 15 µL del Mix B a los pocillos correspondientes a las filas G
y H de la placa para las reacciones de PCR de SCA2 y SCA7. Habrá que rellenar tantas
columnas como número de muestras o controles se vayan a analizar simultáneamente.
6.
Una vez dispensados los mixes para las reacciones de PCR, dispensar 15 µL del Mix B a los
pocillos en los que se deseen llevar a cabo las reacciones de TP-PCR de los SCA2 y SCA7.
7.
Con una pipeta multicanal, añadir 5 µL de los Master-Mix específicos de cada SCA incluidos
en la tira de 8 pocillos del kit a cada columna según el número de muestras o controles.
8.
Añadir 5 µL de los Master Mix específicos de cada TP-PCR (TP SCA2 Master Mix y TP SCA7
Master Mix) a los pocillos donde se vayan a llevar a cabo estas reacciones.
9.
Añadir 5 µL de las muestras diluidas a una concentración de 10 ng/µL a cada pocillo o 5 µL
de agua si se trata de un control negativo de PCR o 5 µl del control positivo, el cual ya se
encuentra a la concentración óptima de amplificación.
10. Colocar los tubos en el termociclador y ejecutar el siguiente programa de amplificación:
Campos
Nº de Ciclos
Temperatura
Tiempo
Tabla 4. Programa de PCR y TP PCR, óptimo para los equipos T3 de Biometra, SimpliAmp Thermal Cycler y
GENEAMP® PCR System 2720 de Applied Biosystems
Es posible detener el protocolo en este punto. Los productos de PCR pueden almacenarse a
4ºC si se va a continuar con el protocolo en las próximas 24 horas o a -20ºC para periodos de
tiempo superiores.
Rev. 5
28/02/2020
Etapa 1
Activación
enzimática
1 ciclo inicial
Desnaturalización
94ºC
94ºC
5 minutos
1 minuto
Etapa 2
PCR o TP-PCR
30 ciclos
Unión de cebadores
Extensión
60ºC
72ºC
1 minuto
2 minutos
Etapa 3
1 ciclo
Finalización de la PCR o
TP-PCR y conservación
72ºC
4ºC
10 minutos
∞
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