MERCK Millipore Auto2D Guia De Inicio Rapido página 11

Preparatie
Reagentia
1. Prepareer en bewaar Reagent Kits
zoals aangegeven in de bij de kits
meegeleverde literatuur, of de volledige
Gebruikershandleiding (online).
2. Laat de volgende producten die
op een lage temperatuur zijn
opgeslagen, op kamertemperatuur
komen (20–25 °C ongeveer 10 minuten).
• IEF Chip
• PAGE Chip
• Rehydration Solution
• DTT Solution
• Amfolyt
3. Prepareer de Working Rehydration
Solution voor rehydratatie van IEF Chip
en extractie/verdunning van eiwitmonster:
Definitieve
Reagentia Volume concentratie
Rehydration
189 µL
Solution
DTT Solution
10 µL 50 mM
(1 M)
Amfolyt* 1–2 μL 0,5–1% v/v
Totaal 200 µL
* Selecteer amfolyt op basis van IEF
chip. Voeg voor amfolyten met 40%
stockconcentratie, 1 µL toe. Voeg voor
amfolyten met 100X, 2 µL toe.
4. Prepareer Working Equilibration Buffer
voor equilibratie van geconcentreerde
eiwitten voor SDS-PAGE.
Definitieve
Reagentia Volume concentratie
Equilibration
760 µL
buffer premix
DTT Solution
40 µL 50 mM
(1 M)
Totaal 800 µL
20424817 Rev 06/21
All manuals and user guides at all-guides.com
Monsterpreparatie
Los het eiwitmonster op in de Working
Rehydration Solution, geprepareerd volgens
stap 3. Het monster mag 2 maal of meer
verdund worden met Working Rehydration
Solution om de gewenste eiwitconcentratie te
bereiken en de zoutconcentratie te verlagen.
Een hoge zoutconcentratie kan eiwitscheiding
beïnvloeden tijdens isoelektrische concentratie
en de stroom 100 µA doen overschrijden.
Monsters met een hoge zoutconcentratie
dienen ontzout te worden door middel van:
TCA/aceton precipitatie en resuspensie van
eiwitten in Working Rehydration Solution
OF
Buffer uitwisseling door middel van
een spinkolom
LET OP: Tijdens eiwitresuspensie dient u de
eiwitten niet boven de 37 °C te verhitten.
Eiwitten kwantificeren. Tussen 0,1–25 µg eiwit
kan worden geladen voor 2D elektroforese. De
optimale hoeveelheid eiwit is afhankelijk van
de detectiemethode en monstercomplexiteit.
De volgende eiwit hoeveelheden dienen als
startpunt te worden gebruikt, de gebruiker kan
de laadhoeveelheid optimaliseren voor hun
eigen monster.
• Coomassie Brilliant Blue staining: 25 µg
• Fluorescent staining: 10 µg
• Silver staining: 5 µg
• Fluorescent pre-labeling: 3 µg
Het geappliceerde monstervolume op het
apparaat is 10–12 µL. Het monster kan worden
verdund met Working Rehydration Solution,
indien noodzakelijk.
Inschakelen van Auto2D Device
®
Selecteer het geschikte stroomsnoer
(meegeleverd met het apparaat) dat compatibel
is met de stopcontacten in uw land. Duw het
juiste uiteinde stevig in de achterkant van
het Auto2D Device, en het andere uiteinde
®
in het stopcontact.
De stroomschakelaar bevindt zich naast de AC
plugpoort achterop het Auto2D ® Device. Druk
de schakelaar omhoog om in te schakelen.
De applicatie wordt automatisch gestart.
Selecteer op het scherm de Auto2D
®
modus (origineel)
20
Laad een procedure
Kies SETTING (instelling) > RECIPE (recept).
Raak het Recipe Information scherm aan.
Selectie dialoogvak voor procedure verschijnt.
Selecteer "RECIPE NAME" (procedure naam) >
LOAD (laden) > OK > EXIT (afsluiten).
Let op: Bevestig dat de gewenste
Procedurenaam rechtsbovenin het scherm
wordt getoond.
Chip montage
PAGE Chip
E Chip
1. Verwijder de witte tape op de anodezijde
van de Chip.
2. Verwijder voorzichtig de plastic folie op de
kathodezijde van de Chip.
3. Spoel de anode en kathodebuffer zachtjes
af met gedestilleerd water. Veeg met
een papieren reinigingsdoekje eventuele
vloeistof van de bovenkant van de Chip
af, waarbij u erop let de dunne strip
op de kathodezijde van de Chip niet te
beschadigen.
Dutch 20424817 Rev 06/21
Plaats de Chips in de bak
Op het Auto2D Device touch screen, kiest u
®
OPEN > OK. Zodra de bak is geopend, plaatst
u de PAGE Chip (lichtblauwe streep)
anodezijde naar voren. Plaats de Solution Chip
(donkerblauwe strepen) bovenop de PAGE Chip
met de cut-off hoekjes naar voren.
Breng de Solutions aan
Kathodezijde
3
3
Anodezijde
1. Kathode buffer, 4500 µL
2. Anode buffer, 4000 µL
3. Gedestilleerd water, 4000 µL
4. Working Equilibration Buffer
a. 700 µL
b. 700 µL (optioneel)
c. 700 µL (optioneel)
5. Working Rehydration Solution, 100 µL
6. Monster, 10–12 μL
7. Moleculair gewicht marker*
0,5–0,7 μL
* zonder SDS of Bromophenol Blue
21
met de
1
7
6
5
a
b 4
c
2
Dutch