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Diluya la uracil-N-glucosilasa en una proporción 1:200 en agua de grado PCR. Para preparar
esta dilución de uracil-N-glucosilasa, puede utilizar el agua de grado PCR contenida en el tubo
para preparar diluciones de UNG, que se incluye en el equipo de ensayo PapilloCheck
nueva dilución de UNG para cada reacción PCR PapilloCheck
8.2.3). No reutilice la UNG diluida.
Mezcle la dilución de UNG con cuidado; para hacerlo, mézclela con un Vortex durante 2 segundos
y después centrifúguela, o bien pipetéela arriba y abajo varias veces.
La concentración original de uracil-N-glucosilasa es 1 U/µl. Por consiguiente, la concentración de
la dilución es 0,005 U/µl.
!
El equipo de ensayo PapilloCheck
Es obligatorio usar esta enzima para lograr el rendimiento previsto.
Añada 1 µl de esta dilución a cada reacción PCR PapilloCheck
Tabla 4).
Esta cantidad es suficiente para eliminar la contaminación cruzada de PCR. Procure no usar una
solución de UNG con mayor concentración, ya que esto podría tener un efecto negativo sobre el
rendimiento de la PCR, lo que reduciría la sensibilidad de PapilloCheck
En general, para el tratamiento de UNG, la mezcla de reacción de PCR se incuba durante 20
minutos a 37 °C. Posteriormente, la UNG se desactiva mediante un paso de incubación adicional
de 15 minutos a 95 °C. Estos dos pasos ya están incorporados en el ensayo PCR PapilloCheck
corresponden a los dos primeros pasos del programa del termociclador (consulte la Tabla 3). Durante
el segundo paso (15 minutos a 95 °C), se producen tanto la inactivación de la uracil-N-glucosilasa
como la activación de la polimerasa HotStarTaq
El sistema de UNG incorporado de la PCR PapilloCheck
!
productos de la PCR de reacciones PCR anteriores. No se podrá eliminar otro tipo de contaminación, por
ejemplo, la que se produce durante la preparación de las muestras, la extracción de ADN o la adición de
la plantilla de PCR. Por lo tanto, para impedir la contaminación es necesario seguir las instrucciones y las
precauciones especiales descritas en el capítulo 7.
8.2.3
Preparación de la reacción de PCR
A excepción de la polimerasa HotStarTaq
ya contiene todos los componentes necesarios para realizar la reacción PCR (tampón de PCR,
MgCl
, dNTPs, cebadores, plantilla de control de PCR).
2
Por lo general, el procedimiento de preparación de la PCR PapilloCheck
dos partes: la preparación de la mezcla maestra final, durante la que se agregan las enzimas al
PapilloCheck
PCR MasterMix, y la preparación de la reacción de PCR final, durante la que se
®
agrega el ADN extraído como plantilla.
!
El equipo de ensayo PapilloCheck
2). Es obligatorio usar esta enzima para lograr el rendimiento previsto.
La preparación de la mezcla maestra final se debe realizar en un entorno con protección, como una
campana PCR, para evitar la contaminación de la reacción.
Manual de instrucciones de PapilloCheck
Revisión: BQ-708-00 / Octubre de 2017
se ha validado con uracil-N-glucosilasa de Thermo Scientific (consulte el capítulo 2).
®
.
®
y la uracil-N-glucosilasa, el PapilloCheck
®
se ha validado con la polimerasa HotStarTaq
®
y PapilloCheck
high-risk
®
®
preparada (consulte el capítulo
®
(consulte el capítulo 8.2.3,
®
.
®
solamente eliminará la contaminación cruzada con
®
®
de Qiagen (consulte el capítulo
®
. Use una
®
y
®
PCR MasterMix
®
se puede dividir en
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