Greiner Bio-One PapilloCheck Manual De Instrucciones página 26

Prepare la mezcla maestra (compuesta por PapilloCheck
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HotStarTaq y uracil-N-glucosilasa) para la cantidad necesaria de reacciones PCR según lo
®
descrito en la Tabla 4.
Para analizar varias muestras, la mezcla maestra final se debe preparar en un lote (en la cantidad
necesaria para todos los análisis). Para adaptarse a las variaciones de volumen durante el pipeteado,
se recomienda aumentar el número de reacciones (n) a tenor de 1 por cada microchip (=n+1), por
ejemplo, prepare un volumen de la mezcla maestra final para 13 reacciones de amplificación si se
van a analizar 12 muestras (consulte la Tabla 4).
!
Se recomienda incluir un control negativo para cada lote de mezcla maestra final preparada. Se pueden usar
como control negativo el tampón de elución del ADN del equipo de extracción de ADN adecuado o agua de
categoría PCR.
Mezcle por completo la mezcla maestra final; para ello, mézclela con un Vortex durante 2
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segundos y después centrifúguela, o bien pipetéela arriba y abajo varias veces.
Divida la mezcla maestra final en alícuotas pipeteando 21 µl para cada reacción PCR en un tubo

de ensayo fino para PCR de 0,2 ml.
Realice la adición del ADN mensajero en una zona de trabajo diferente a la de la preparación de la
mezcla maestra final (consulte el capítulo 7.2).
Para la preparación de la mezcla de reacción, añada 5 µl del ADN extraído en cada la mezcla
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maestra final, mézclelo con un Vortex durante 2 segundos y después centrifúguelo, o bien
pipetéelo arriba y abajo varias veces. El volumen total de una reacción PCR es 26 µl.
Coloque los tubos de ensayo en el termociclador e inicie la reacción PCR con el programa del
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termociclador descrito en el capítulo 8.2.1 (Tabla 3).
!
Una vez completada la PCR, los productos de la amplificación se deben utilizar inmediatamente para la
hibridación, o bien almacenar a oscuras a ≤ -20 °C durante una semana.
Tabla 4: Preparación de la reacción PCR PapilloCheck
PapilloCheck
®
PCR MasterMix
Polimerasa ADN HotStarTaq
(5 U/µl)
Uracil-N-glucosilasa
(dilución de 1:200,
0,005 U/µl)
Volumen total antes de
añadir el ADN de muestra
(mezcla maestra final)
ADN extraído de muestra
cervicouterina (ADN
mensajero)
Volumen total por reacción
(reacción PCR final)
Manual de instrucciones de PapilloCheck
Revisión: BQ-708-00 / Octubre de 2017
®
13 reacciones
1 reacción
(1 microchip)
19,8 µl 257,4 µl
®
0,2 µl 2,6 µl
1 µl 13 µl
21 µl 273 µl
5 µl
26 µl
y PapilloCheck high-risk
® ®
PCR MasterMix, polimerasa
®
26 reacciones 39 reacciones
(2 microchips) (3 microchips)
514,8 µl 772,2 µl
5,2 µl 7,8 µl
26 µl 39 µl
546 µl 819 µl
52 reacciones
(4 microchips)
1029,6 µl
10,4 µl
52 µl
1092 µl
26