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Sección 3
Teoría de la PCR en tiempo real
Manual de funcionamiento del m2000rt
50-608336/R2—Julio de 2010
La detección del producto de la PCR puede efectuarse, por
ejemplo, mediante electroforesis en gel y procesamiento
posterior de la reacción a fin de determinar la cantidad de
producto a través del inmunoensayo enzimático. Hoy en día,
es más frecuente el uso de sondas de oligonucleótidos con
etiqueta de fluorescencia, las cuales son fluorescentes cuando
se unen a una secuencia objetivo específica y se inhiben; no
son fluorescentes en ausencia de objetivo. La propiedad de
fluorescencia e inhibición de las sondas de PCR permite PCR
homogéneas en que todos los reactivos necesarios se añaden
a la muestra antes de la amplificación y la detección de un
producto de PCR específico a medida que se acumula durante
esta reacción. Dado un proceso de ciclo térmico adecuado,
las sondas se unen a la secuencia objetivo durante el proceso
de amplificación, lo que proporciona una medida fluorescente
para el producto de amplificación. Esto corresponde a la base
de los ensayos de PCR en tiempo real. No se necesitan
reactivos adicionales para la detección, lo que permite sellar
la reacción y, a su vez, reducir la posibilidad de contaminación
en el laboratorio.
La PCR en tiempo real integra un sistema de detección
óptica con el hardware de permutación cíclica térmica,
lo que permite que el sistema de detección mida el progreso
de la PCR durante el curso de la reacción (es decir, ciclo por
ciclo) mediante el uso de sondas fluorescentes unidas a la
secuencia objetivo amplificada. Los datos de la respuesta
de fluorescencia se recopilan durante todo el proceso
de permutación cíclica, lo que produce la detección
de curvas de crecimiento de fluorescencia de PCR.
Principios de funcionamiento
PCR en tiempo real
3-5
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