Qiagen Rotor-Gene Q MDx Manual Del Usuario página 182

Mantenga unos niveles similares de concentración de muestra posamplificación
La concentración de un fragmento de ADN afecta a su temperatura de disociación (T ). Por este
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motivo, los niveles de concentración del ADN de la muestra deben mantenerse lo más similares
posibles. Cuando analice productos de PCR, deberá garantizar que todas las reacciones se
amplifican hasta la fase de meseta. En la fase de meseta, todas las reacciones se habrán
amplificado en la misma medida, independientemente de la cantidad inicial. Sin embargo,
recuerde que las reacciones leves podrían no alcanzar la fase de meseta con la misma cantidad
amplificada. Esto podría deberse, por ejemplo, a una configuración incoherente del ensayo (es
decir, si la concentración del cebador era demasiado baja).
Garantice la uniformidad entre muestras
Todas las muestras deben tener el mismo volumen y el mismo nivel de concentración de colorante.
El comportamiento de disociación del ADN se ve afectado por las sales presentes en la mezcla de
reacción, por lo que es importante que la concentración del tampón, Mg y otras sales sea lo más
uniforme posible en todas las muestras. Igualmente, utilice solo tubos de reacción idénticos, del
mismo fabricante, para evitar variaciones derivadas del grosor del plástico y las propiedades
autofluorescentes.
Permita una cantidad de datos suficiente para las fases de predisociación y posdisociación
Recoja los datos de puntos de HRM de un intervalo de 10 °C aproximadamente, tomando como
punto de referencia el T analizado (consulte la figura de la página 10). Así, dispondrá de
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suficientes puntos de datos de base para una normalización de la curva eficaz, lo que dará lugar
a duplicados más reproducibles y una interpretación de los datos más sencilla.
Manual del usuario de Rotor-Gene Q MDx CE 02/2022 182