Beckman Coulter IM3632 Manual De Instrucciones página 19

9. Die Stem-Count oder Flow-Count Fluorospheres vorsichtig vermischen, indem Sie das Röhrchen vor der
Verwendung 3 bis 5 mal umdrehen. Ein zu starkes Vermischen ist nicht ratsam, um die Bildung von Luftblasen
zu vermeiden.
10.Vor der Entnahme 100 µL von Stem-Count oder Flow-Count Fluorospheres in das Probenröhrchen pipettieren.
11. Sofort nach jedem Hinzufügen 5 Sekunden lang vortexen. Bei 2–8 °C lagern. Drehvorgang unmittelbar vor
der Entnahme für die Durchflusszytometrie wiederholen.
WICHTIG:
Übersicht über Vorbereitung (Etikett des Probenröhrchens: TROL45/34/7-AAD)
Reagenzien und Proben
CD45-FITC / CD34-PE
7-AAD-Lebensfähigkeits-Farbstoff
Vollblut
Stem-Trol Control Cells
Vortex – 20 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren lassen. Vor Lichteinfall schützen
1X NH Cl Lysing Solution
4
Vortex – 10 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren lassen. Vor Lichteinfall schützen
Stem-Count Fluorospheres
MANUELLE GATE- UND ANALYSEMETHODE
Aufbau des Protokolls
Der Durchflusszytometer muss zur Erkennung von „Forward Scatter" (Vorwärtsstreuung), „Side Scatter" (seitliche
Streuung) und von vier Fluoreszenz-Kanälen ausgestattet sein. Für den FL3-Kanal (für die Überwachung von
Stem-Count oder Flow-Count Fluorospheres) einen 620-nm-Bandpassfilter benutzen. Für den FL4-Kanal (für die
Überwachung von 7-AAD Viability Dye-Vitalitätsfarbstoff) einen 675 nm langen Passfilter benutzen.
ANMERKUNG: Für die Stem-Trol Control Cells muss dasselbe Gate-Schema und dieselbe Reihe mit 8
Histogrammen, wie für die Probenanalyse angegeben, befolgt werden. Da Stem-Trol
Control Cells ähnliche Größenmerkmale aufweisen und CD45- und CD34-Antigene
in einer Dichte annähernd der normalen unreifen blutbildenden Zellen exprimieren,
müssen die Regionsgrenzen entlang der Kanäle „Forward Scatter" (Vorwärtsstreuung),
Fluorescence 1 (Fluoreszenz 1) und Fluorescence 2 (Fluoreszenz 2) nicht geändert
werden. Da die „Side Scatter"-Merkmale (seitliche Streuung) von Stem-Trol Control
Cells jedoch eindeutig sind, müssen Sie die Regionsgrenzen entlang von „Side Scatter"
(seitliche Streuung) möglicherweise justieren. Die Regionen A, B, C und D (siehe die
Überschrift „Region Creation" (Regionserstellung) für eine Definition der Regionen)
müssen so geändert werden, dass der Merkmals-Cluster für die Stem-Trol Control
Cells enthalten ist.
Erstellen der Histogramme
Folgende Histogramme anlegen:
1. Histogramm 1 für FL1 CD45-FITC vs. „Side Scatter" (seitliche Streuung) erstellen.
2. Histogramm 2 für FL2 CD34-PE vs. „Side Scatter" (seitliche Streuung) erstellen.
3. Histogramm 3 für FL1 CD45-FITC vs. „Side Scatter" (seitliche Streuung) erstellen.
4. Histogramm 4 für „Forward Scatter" (Vorwärtsstreuung) vs. „Side Scatter" (seitliche Streuung) erstellen.
5. Histogramm 5 für FL1 CD45-FITC vs. FL2 CD34-PE erstellen.
6. Histogramm 6 für „Forward Scatter" (Vorwärtsstreuung) vs. „Side Scatter" (seitliche Streuung) erstellen.
7. Histogramm 7 für Zeit vs. FL3 Stem-Count oder Flow-Count Fluorospheres erstellen.
8. Histogramm 8 für FL4 7-AAD vs. „Side Scatter" (seitliche Streuung) erstellen.
B60231–AE
Es besteht das Risiko fehlerhafter Ergebnisse, wenn die Proben mehr als 1 Stunde nach
dem Hinzufügen der Stem-Count oder Flow-Count Fluorospheres analysiert werden.
Vorbereitete Proben müssen innerhalb 1 Stunde nach dem Hinzufügen der Stem-Count
oder Flow-Count Fluorospheres analysiert werden.
Volumen
20 µL
20 µL
100 µL
20 µL
2 mL
100 µL
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