Beckman Coulter IM3632 Manual De Instrucciones página 70

FONTOS:
Az előkészítés összefoglalása (mintacső címkéje: TROL45/34/7-AAD)
Reagensek és minták
CD45-FITC / CD34-PE
7-AAD életképesség-festék
Teljes vér
Stem-Trol Control Cells
Vortexelje, majd hagyja 20 percig inkubálódni szobahőmérsékleten. Fénytől védendő.
1X NH Cl Lysing Solution
4
Vortexelje, majd hagyja 10 percig inkubálódni szobahőmérsékleten. Fénytől védendő.
Stem-Count Fluorospheres
KÉZI KAPUZÁSI ÉS VIZSGÁLATI MÓDSZER
A protokoll beállításai
Az áramlási citométer alkalmas kell, hogy legyen a Forward Scatter (előre szóródás), a Side Scatter
(oldalra szóródás) és négy fluoreszcenciás csatorna mérésére. Az FL3 csatornához (a Stem-Count vagy a
Flow-Count Fluorospheres monitorozására) használjon 620 nm-es sáváteresztő szűrőt. Az FL4 csatornához (a
7-AAD vitális festék monitorozására) használjon 675 nm-es aluláteresztő szűrőt.
MEGJEGYZÉS: A Stem-Trol Control Cells vizsgálata esetén ugyanazt a kapuzási sémát és
8 hisztogramot kell használni, amelyeket a minták vizsgálatához. Mivel a
Stem-Trol Control Cells méretbeli jellemzői és CD45- és CD34-expresszió sűrűségi
jellemzői közelítőleg azonosak a normál éretlen hemopoetikus sejtekéivel, nem
szükséges módosítani a Forward Scatter (előre szóródás), a fluoreszcencia 1 és a
fluoreszcencia 2 csatorna területi határait. Mivel azonban a Stem-Trol Control Cells Side
Scatter (oldalra szóródási) jellemzői egyediek, módosíthatók a területhatárok a Side
Scatter (oldalra szóródás) mentén. Az A, B, C és D területet (a definíciót lásd a Területek
létrehozása fejezetben) módosítani kell, hogy tartalmazzák a Stem-Trol Control Cells
jellemző csoportját.
Hisztogram létrehozása
Hozzon létre hisztogramokat a következők szerint:
1. Hozza létre az 1. hisztogramot: FL1 CD45-FITC vs. Side Scatter (oldalra szóródás).
2. Hozza létre a 2. hisztogramot: FL2 CD34-PE vs. Side Scatter (oldalra szóródás).
3. Hozza létre az 3. hisztogramot: FL1 CD45-FITC vs. Side Scatter (oldalra szóródás).
4. Hozza létre a 4. hisztogramot: Forward Scatter (előre szóródás) vs. Side Scatter (oldalra szóródás).
5. Hozza létre az 5. hisztogramot: FL1 CD45-FITC vs. FL2 CD34-PE.
6. Hozza létre a 6. hisztogramot: Forward Scatter (előre szóródás) vs. Side Scatter (oldalra szóródás).
7. Hozza létre a 7. hisztogramot: Idő vs. FL3 Stem-Count vagy Flow-Count Fluorospheres.
8. Hozza létre a 8. hisztogramot: FL4 7-AAD vs. Side Scatter (oldalra szóródás).
Az 1–4. hisztogramok a CD34
Ez az első négy hisztogram az ISHAGE Guidelines for CD34+ Cell Determination by Flow Cytometry (Irányelvek
CD34 sejtek meghatározása áramlási citometriával) dokumentumnak megfelelően van beállítva (2,3).
+
Az 5–7. hisztogramok olyan paraméterek monitorozására szolgálnak, amelyek fontosak lehetnek az adatmérési
lépés során. Ide tartozik a Forward Scatter (előre szóródás) diszkriminátor, az összegyűjtendő CD45
száma és az egyedi fluoreszcenciás gömbök összegyűlése.
A 8. hisztogram az élő és a nem élő sejtek által okozott események megkülönböztetésére és elemzésére szolgál.
B60231–AE
Hibás eredmények veszélye áll fenn, ha a minta vizsgálata a Stem-Count
vagy Flow-Count Fluorospheres gömbök hozzáadása után több mint 1 órával
történik. Az elkészített minták vizsgálatát el kell végezni a Stem-Count vagy
Flow-Count Fluorospheres gömbök hozzáadása után 1 órán belül.
HPC jellemzésére szolgálnak; ezt az eljárást el lehet halasztani az elemzési lépésig.
+
Térfogat
20 µL
20 µL
100 µL
20 µL
2 mL
100 µL
70 of 128
események
+