Beckman Coulter IM3632 Manual De Instrucciones página 92

Hazırlama Özeti (Tüp Etiketi: TROL45/34/7-AAD)
Reaktifler ve Örnekler
CD45-FITC / CD34-PE
7-AAD Viyabilite Boyası
Tam Kan
Stem-Trol Control Cells
Vorteks – 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Işıktan koruyun
1X NH Cl Lysing Solution
4
Vorteks – 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Işıktan koruyun
Stem-Count Fluorospheres
MANUEL GEÇİTLEME VE ANALİZ YÖNTEMİ
Protokol Ayarı
Akış sitometresi; Forward Scatter (Öne Saçılma), Side Scatter (Yana Saçılma) ve dört floresans kanalını
algılayacak donanıma sahip olmalıdır. FL3 kanalı için (Stem-Count veya Flow-Count Fluorospheres izleme için)
620 nm bant geçiş filtresi kullanın. FL4 kanalı için (7-AAD Viability Dye izleme için) 675 nm uzun geçiş filtresi
kullanın.
NOT: Stem-Trol Control Cells için de numune analizi için belirtilen geçitleme şemasının ve
8 histogramlık serinin aynısı izlenmelidir. Stem-Trol Control Cells normal immatür
hematopoietik hücrelere yakın özelliklere sahip olup yaklaşan yoğunluklarda CD45 ve
CD34 antijenlerini eksprese ettiğinden Forward Scatter (Öne Saçılma), Fluorescence
1 (Floresans 1) ve Fluorescence 2 (Floresans 2) kanalları boyunca bölge sınırlarının
değiştirilmesi gerekli değildir. Ancak, Stem-Trol Control Cells Side Scatter (Yana
Saçılma) özellikleri benzersiz olduğundan Side Scatter (Yana Saçılma) boyunca
bölge sınırlarını ayarlayabilirsiniz. A, B, C ve D bölgeleri (bölge tanımı için Bölge
Oluşturma başlığına bakın) Stem-Trol Control Cells özellik kümesini içerecek şekilde
değiştirilmelidir.
Histogram Oluşturma
Histogramları aşağıdaki gibi oluşturun:
1. FL1 CD45-FITC'ye karşılık Side Scatter (Yan Saçılma) olarak Histogram 1'i oluşturun.
2. FL2 CD34-PE'ye karşılık Side Scatter (Yana Saçılma) olarak Histogram 2'yi oluşturun.
3. FL1 CD45-FITC'ye karşılık Side Scatter (Yan Saçılma) olarak Histogram 3'i oluşturun.
4. Forward Scatter'a (Öne Saçılma) karşılık Side Scatter (Yan Saçılma) olarak Histogram 4'yı oluşturun.
5. FL1 CD45-FITC'ye karşılık FL2 CD34-PE olarak Histogram 5'i oluşturun.
6. Forward Scatter'a (Öne Saçılma) karşılık Side Scatter (Yan Saçılma) olarak Histogram 6'yı oluşturun.
7. Süre - FL3 Stem-Count veya Flow-Count Fluorospheres olarak Histogram 7'yi oluşturun.
8. FL4 7-AAD'ye karşılık Side Scatter (Yan Saçılma) olarak Histogram 8'i oluşturun.
1 ile 4 arasındaki histogramlar, analiz adımına kadar ertelenebilecek CD34
yöneliktir. Bu ilk dört histogram, Akış Sitometrisi ile CD34
Yönergeleri'ne (2,3) uygun olarak ayarlanır.
Histogram 5 ila 7, edinme adımı sırasında önemli olan parametreleri izlemeye yöneliktir. Bunlar Forward Scatter
(Öne Saçılma) ayrıştırıcısını, toplanacak CD45
Histogram 8, gerektiğinde uygulanabilir olayları uygulanamaz olaylardan ayırt etmeye yöneliktir.
Bölge Oluşturma
Bölgeleri aşağıdaki gibi hazırlayınız:
1. Histogram 1 – Tüm CD45
ortadan kaldıran doğrusal bir A Bölgesi oluşturun.
2. Histogram 1 – Lenfositler üzerinde şekilsiz bir E Bölgesi oluşturun (parlak CD45, düşük yan saçılma).
B60231–AE
olaylarının sayısını ve doğru florosfer singlet birikimini içerir.
+
lökositlerini içeren ve trombositleri, kırmızı kan hücreleri birikintilerini ve agregatları
+
Hacim
20 µL
20 µL
100 µL
20 µL
2 mL
100 µL
Hücre Determinasyonuna Yönelik ISHAGE
+
92 of 128
HPC işlemini karakterize etmeye
+